Zastosowanie wysokoprzepustowego sekwencjonowania do kontroli jakości wybranych szczepionek dla drobiu

Abstract

STRESZCZENIE: Państwowy Instytut Weterynaryjny – Państwowy Instytut Badawczy w Puławach jest jedynym w Polsce weterynaryjnym laboratorium europejskim o randze OMCL. Zgodnie ze swoim statusem przynależności do sieci GEON, PIWet-PIB wykonuje szereg badań z zakresu urzędowej kontroli jakości immunologicznych weterynaryjnych produktów leczniczych, na podstawie wymogów Farmakopei Europejskiej. Kontrola ta obejmuje zarówno badania fizykochemiczne jak i biologiczne, natomiast nadal brak jest wytycznych dotyczących kontroli genomowej szczepionek weterynaryjnych. Pierwsze kroki w celu wdrożenia nowatorskich metod wysokoprzepustowego sekwencjonowania HTS w kontroli jakości szczepionek postawiła już farmacja dla ludzi, natomiast niniejsza praca jest pierwszą w Polsce i jedną z nielicznych na świecie, dotyczącą takich badań w farmacji weterynaryjnej. Pierwszym zadaniem pracy była analiza unikatowej bazy danych kontroli seryjnej wstępnej IWPL. Analiza ta pozwoliła na wynotowanie liczby dawek wszystkich szczepionek dla drobiu wprowadzanych do obrotu w Polsce na przełomie lat 2018-2020, a przez to wybór najczęściej wprowadzanych do obrotu szczepionek do kolejnego etapu badań – analiz laboratoryjnych. Odnotowano 19 jednostek chorobowych drobiu, dla których w wyżej wymienionych latach prowadzona była immunoprofilaktyka w Polsce. Większość stanowiły szczepionki wiusowe (96,8%) a wśród nich IWPL przeciwko zakaźnemu zapaleniu oskrzeli kur, natomiast pozostałe to szczepionki bakteryjne (1,9%) z dominującymi preparatami przeciwko salmonellozie oraz szczepionki pasożytnicze (1,3%). Analiza elektronicznej bazy danych pozwoliła na wynotowanie typów oraz szczepów szczepionkowych poszczególnych IWPL na polskim rynku przeciwko IB (typy: Mass, 793B, QX, Var2) oraz Salmonella (serowary: Enteritidis; Gallinarum, Pullorum; Typhimurium). Kolejnym celem pracy było wdrożenie metody HTS do kontroli jakości wirusowych oraz bakteryjnych szczepionek dedykowanych dla drobiu, począwszy od etapu ekstracji materiału genetycznego aż po stwierdzenie zgodności serowaru/serotypu szczepionkowego z deklaracją podaną przez producenta. Do badań wykorzystano po trzy serie szczepionek wirusowych (V-01: szczep 4/91, typ 793B; V-02: szczep Ma5, typ Mass; V-03: szczep D388, typ QX) oraz bakteryjnych (B-01: szczep 441/014 S. Enteritidis; B-05: szczep Sm24/Rif12/Ssq S. Enteritidis; B-07: CAL10 Sm+/Rif+/Ssq S. Enteritidis). Wszystkie badane próbki spełniały standardy jakości w zakresie stężenia materiału genetycznego oraz stopnia integralności. W następstwie analiz wysokoptrzepustowego sekwencjonowania, badania prowadzone z użyciem narzędzi bioinformatycznych wykazały, że metoda HTS jest skuteczna w analizie składu genetycznego, analizie filogenetycznej a także analizie serotypu/serowaru i szczepu szczepionkowego zarówno szczepionek wirusowych jak i bakteryjnych. W przypadku szczepionek wirusowych, łączne wykorzystanie dwóch narzędzi: Kraken2 oraz BWA, pozwoliło na identyfikację Avian coronavirus w każdej próbce badanej jako odczytów dominujących (V-01: 70-75%; V-02: 81-83%; V-03: 43-63%). Zadeklarowane przez producenta szczepy szczepionkowe zostały potwierdzone zarówno przy pomocy narzędzia BLAST: 4/91 (V-01), Ma5 (V-02), QX (V-03), jak i z wykorzystaniem wyników analizy filogenetycznej regionu kodującego S1 oraz WGS, które potwierdziły najwyższe podobieństwo szczepu: V-01 do 4/91, V-02 do Ma5 oraz V-03 do 1148-A QX. Ponadto metoda HTS okazała się być skuteczna w ocenie homogenności subpopulacji wirusa szczepionkowego, poprzez kontrolę występowania wariantów. Największą zmienność odnotowano dla V-01 (17 SNP), średnią dla V-02 (4 SNP), natomiast najbardziej stabilna genetycznie była V-03 (3 SNP). W przypadku szczepionek bakteryjnych, wykazano, iż serowar Enteritidis może być potwierdzony za pomocą następujących narzędzi: Kraken2 (99,5% odczytów Salmonella enterica), SeqSero2, JSpeciesWS oraz SISTR. Ostatnie z wymienionych narzędzi, SISTR, pozwoliło dodatkowo na identyfikację szczepów szczepionkowych. Wykonane analizy potwierdziły bliskie pokrewieństwo szczepów B-05 oraz B-07. Analiza SISTR potwierdziła, że obie szczepionki zawierają ten sam szczep szczepionkowy CHS44. Analiza filogenetyczna wykazała, iż oba wymienione preparaty znajdują się w jednym klastrze drzewa filogenetycznego. Ponadto analiza cgMLST potwierdziła, że cgST było identyczne dla wszystkich serii B-05 oraz B-07 i wynosiło 81326. Wykazano brak jakichkolwiek różnic pomiędzy allelami w genomie obu szczepionek, podczas gdy pomiędzy B-05 i B-07 a B-01, wykazano różnice w liczbie 162 alleli. Metoda HTS pozwoliła również na detekcję genów oporności na środki przeciwbakteryjne w szczepionkach bakteryjnych. Dwa z trzech użytych narzędzi bioinformatycznych (AMRfinder_2 oraz CARD) zidentyfikowały geny kodujące podjednostki pomp efluksowych RND, charakterystycznych m.in. dla rifampicyny, czyli tego antybiotyku na który oporność szczepów bakteryjnych deklarował producent. Wykazano także, że metoda HTS z zastosowaniem narzędzia PlasmidFinder 2.1 jest skuteczna w detekcji replikonów plazmidowych w szczepionkach bakteryjnych. Przeprowadzone analizy pozwoliły na potwierdzenie, że we wszystkich seriach preparatów B-05 oraz B-07, wystepują geny replikonów plazmidowych, co wskazuje nie tylko na obecność plazmidu ale także na konieczność prowadzenia tego typu badań monitoringowych z uwagi na możliwość horyzontalnego transferu genów. Ponadto gen replikonu plazmidowego IncFIB(S)_1 oraz IncFII(S) znajdowały się na tym samym kontigu, co świadczy o obecności plazmidu multireplikacyjnego. Przeprowadzone badania są dowodem na zasadność technologii HTS w kontroli jakości szczepionek weterynaryjnych dedykowanych dla drobiu, a tym samym stanowią fundament analiz kolejnych grup szczepionek. Ponadto, wyniki badań, takie jak identyfikacja genów kodujących podjednostki pomp efluksowych oraz genów replikonów plazmidowych w szczepionkach Salmonella czy też identyfikacja wariantów unikatowych w szczepionkach IB, są dowodem na konieczność wzmożenia prac nad wdrażaniem wytycznych badań genomicznych przez organizacje takie jak EDQM we współpracy z laboratoriami OMCL oraz producentami szczepionek.